本发明公开了一种分离制备矮牵牛素‑3‑O‑葡萄糖苷的方法，包括醇提浓缩、大孔树脂吸附、制备液相色谱纯化和高速逆流色谱分离，从花色苷组成复杂的蓝莓原料中分离制备矮牵牛素‑3‑O‑葡萄糖苷单体。本发明首次将制备液相色谱和高速逆流色谱技术结合，并通过对工艺参数的优化，从蓝莓中分离得到高纯度的矮牵牛素‑3‑O‑葡萄糖苷单体，其纯度可高达99％。