本发明公开了一种蛋白酶拆分制备手性3‑环己烯‑1‑甲酸的方法，所述方法为：以外消旋3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯为底物，以碱性蛋白酶为催化剂，以pH为7.5的磷酸盐缓冲液为反应介质，在20～60℃条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸和(R)‑3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯。本发明拆分反应条件温和、操作工艺简单、设备需求较低、反应不存在副反应、得到的手性化合物光学纯度高，(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸的ee值从化学拆分法的98％提高到99.5％，得率高达32.8％；(R)‑3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯的ee值高达74.2％，得率高达41.1％。