本发明公开了一种基于纳米金刚石与肌红蛋白修饰的电化学酶传感器的制备方法与应用；首先称取适量石墨粉和离子液体于研钵中，充分研磨使混合均匀，将其填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作导线，制备碳离子液体电极(CILE)；将纳米金刚石(ND)分散于去离子水中配制成不同浓度的分散液，超声2~3 h使分散均匀，取一定体积纳米金刚石分散液滴涂于CILE表面，室温下晾干后得到ND/CILE；再将肌红蛋白(Mb)固定在ND/CILE表面室温下晾干得到Mb/ND/CILE；最后将Nafion乙醇溶液涂布在Mb/ND/CILE表面，室温下晾干得到电化学酶传感器(Nafion/Mb/ND/CILE)。进一步以Nafion/Mb/ND/CILE为工作电极，应用于三氯乙酸、亚硝酸钠和过氧化氢等目标物的电化学检测，能够有效准确的测定且检测响应时间短、检出限低、线性范围宽、稳定性好。