本发明涉及一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法。其特征是对微生物发酵制备的纳米纤维素发酵液分别采用高温灭菌，离心除菌，等电点法与有机溶剂萃取法结合除蛋白，有机溶剂萃取除小分子有机物，对所得产物进行无机盐脱除，色谱分离法除异形多糖后，再对纤维素进行分级即可获得不同粒度的细菌纳米纤维素。本发明所提供的一种分离提纯细菌纳米纤维素的方法工艺简单、生产成本低、生产周期短的，可高收率得到高纯度、粒度可控的细菌纳米纤维素。