本发明公开了一种在常规PCR技术基础上改进了的线粒体基因组全序列测定方法，目的是提供一种成本低，实验技术简单而且快速的线粒体基因组全序列测定新方法。本发明的特征在于模板的筛选和PCR引物的设计，确定了能作为模板的近缘物种线粒体全序列的最低同源性；将引物的设计分2批进行，并将镶嵌PCR方法引入序列扩增过程中；给出了PCR引物设计的一般规则。本发明主要用于线粒体基因组全序列测定，为遗传学、分子生物学等基础科学研究服务。