本发明提供了一种微生物发酵高三尖杉酯碱的提取方法及其应用，所述提取方法包括如下步骤：(1)对微生物发酵物进行分离，得菌体和去除菌体的发酵液，将去除菌体的发酵液或菌体采用有机溶剂萃取、复溶后得粗提液；(2)所得粗提液采用大孔树脂或活性炭进行吸附、解吸附得生物碱粗提取物；(3)所得生物碱粗提取物经高效液相纯化获得高三尖杉酯碱(或先经硅胶柱层析纯化得高三尖杉酯碱粗品；高三尖杉酯碱粗品再经高效液相纯化获得高三尖杉酯碱)。本发明以微生物发酵物为原料，成本低；工艺简单，可以从微生物菌体或微生物发酵液中高效率、高产率地提纯获得高三尖杉酯碱。