本发明公开了大青中抗氧化剂类叶升麻苷的制备方法，包括以下步骤：将大青叶粗提物用石油醚或二氯甲烷或乙酸乙酯或正丁醇萃取，制得萃取物；将所述萃取物依次用洗脱剂Ⅰ对所述样品进行梯度洗脱，收集目标组分Ⅰ；将目标组分Ⅰ倾入聚酰胺色谱柱，用洗脱剂Ⅱ进行等度洗脱，洗脱后收集目标组分Ⅱ，将所述目标组分Ⅱ倾入C18反相色谱柱，依次用洗脱剂Ⅲ进行梯度洗脱，洗脱后收集目标组分Ⅲ，再将目标组分Ⅲ倾入聚酰胺色谱柱，用洗脱剂Ⅳ进行等度洗脱，洗脱后即制得所述类叶升麻苷；采用本发明所提供的大青中抗氧化剂类叶升麻苷的制备方法可高效的从大青叶中提取出类叶升麻苷，其提取率达到13.03％～18.38％，为从大青中开发抗氧化剂提供了理论依据。