本发明公开了一种基于ccdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法。将ccdB基因插入载体pUC18的EcoRI和HindIII位点之间，得到pUC18‑ccdB质粒，然后将pUC18‑ccdB质粒、DNA片段、限制性内切酶SmaI、T4连接酶、T4连接酶buffer和水混合形成反应体系进行反应，由此得到连接产物。本发明以常见的pUC18载体为骨架载体，结合ccdB致死基因的筛选机制以及ccdB致死基因内部含有的SmaI酶切位点，构建出一套快速、高效、低背景的克隆方法，无需对ccdB重组载体及PCR产物进行双酶切及胶回收等步骤，可以直接将PCR产物连接到克隆载体，效率高，整个时间控制在20分钟以内，极大地减少了实验成本，加快了实验进度，该克隆体系具有极为广阔的应用前景。