本发明属于生物活性肽技术领域，公开了一种线纹海马ACE抑制肽的制备方法，所述线纹海马ACE抑制肽的制备方法选用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶法酶解5h，酶解条件为料液比1g∶15mL、加酶量9.0％w/w、pH＝9.5、底物浓度6％。本发明使用双酶法水解为海马蛋白，以解决单酶水解效率低的问题；双酶同加具有操作简易、速率更快等优点；选择两种酶的适宜温度和pH值都接近，且来源广泛，价格低廉，适用于工业化大规模生产。