本发明公开一种基于CRISPR/Cas9和λ‑Red的无痕化双靶点基因组编辑系统，其特征在于：1.pKS9分子量11, 681kb，为温敏性质粒。含有基因：受四环素诱导的cas9和recX基因；受阿拉伯糖诱导的λ‑Red完整αβγ重组酶基因；抗性基因ampr。2.pCSK分子量2, 914kb，含有两个用于特异性识别基因组的sgRNA插入位点；两个受鼠李糖诱导、用于自身质粒消除的间隔区gRNA序列；抗性基因kanr。3.在同源臂27bp时，同时双点突变效率皆在92%以上；在同源臂40bp时，同时双基因的1kb替换效率在60%以上，当大片段基因替换和点突变同时进行时，各自的编辑效率不受影响。