本发明公开了一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法，以串联的Ultrahydrogel 500柱和Ultrahydrogel 120柱为色谱柱，以含0.01~0.05wt%叠氮化钠的0.01~0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液为流动相。本发明通过色谱柱及流动相的选择，能够便捷、快速的实现不同分子量的金钗石斛多糖的分离，提高了金钗石斛多糖分子量分布的准确度。经验证，本发明方法与采用单一色谱柱或其他类型的色谱柱串联的方法相比，峰形好、结果重现性高、分离度好、准确度高、分子量检测范围宽，具有普遍适用性。