本发明公开了一种制备樟子松针叶原生质体的方法，属于物细胞生物技术领域。所述方法包括(1)获得墇子松幼苗针叶，获得所述针叶叶条；(2)将所述叶条进行预处理；(3)将叶条放入酶解液中进行酶解；(4)将叶条从酶解液中取出，放入W5' 溶液中，室温、避光、振荡，使得原生质体释放至所述W5' 溶液中；(5)将包含原生质体的W5' 溶液转移至100μm的尼龙网上进行过滤；(6)将包含原生质体的W5' 溶液置于冰上30min，吸取上清液，加入预冷的W5' 溶液中重悬原生质体。利用本发明，可获得较多数量并且状态良好、耐受性强的原生质体。