本发明公开了一种双水相萃取结合超滤法制备木瓜蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)将未成熟的青皮木瓜进行破碎处理，将破碎后的木瓜加入到由乙二胺四乙酸、氯化钠和半胱氨酸盐酸盐组成的溶液中进行充分混合；(2)将混合液中不溶的皮渣过滤掉，将过滤后得到的滤液在3‑10℃环境下经离心、冷冻干燥后得到木瓜乳汁粗提酶；(3)将木瓜乳汁粗提酶加入到由成相剂、萃取辅助剂组成的四元双水相体系中，经充分混合后，静止待形成明显的上下相，含酶的萃取液位于上相，回收上相，对上相萃取液进行超滤处理；(4)对超滤后的液体进行浓缩处理；浓缩液经冷冻干燥后，获得纯净的木瓜蛋白酶。使用该方法可以获得较高的产品纯度和回收率，适合工业推广应用。