本发明公开了半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在制备可注射原位形成的水凝胶中的应用。该方法是通过修饰透明质酸的羟基，得到具有稳定醚键的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物，在此反应过程中引入了四丁基氢氧化铵这种新方法增加了透明质酸的溶解度并且提高了反应效率，所得到的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物具有巯基活性基团，不但增加了透明质酸的粘附性，还可继续功能化，且本发明运用所制备的半胱氨酸功能化的透明质酸结合物与聚乙二醇结合物通过自然化学连接反应或迈克尔加成反应生成了可注射原位形成的水凝胶，经流变学研究具有良好的流变学性质，并且凝胶性能可控，在生物医药领域具有广阔的应用前景。