本发明公开了金鲳鱼内脏蛋白酶的分离方法、蛋白酶及其应用，包括对新鲜金鲳鱼的内脏脱脂、浸提、离心后得到蛋白酶粗酶液，然后采用硫酸铵对蛋白酶粗酶液进行粗分离得到复合蛋白酶液，最后采用SephadexG-100凝胶分离步骤2得到的复合蛋白酶液得到三种不同的蛋白酶，记为蛋白酶组分1、蛋白酶组分2、蛋白酶组分3。本发明方法充分利用金鲳鱼加工过程中的生产残渣，在金鲳鱼内脏中提取到了明胶降解能力强且专一的蛋白酶，为分解明胶的蛋白酶提取开辟了新的途径，提高额金鲳鱼的利用率，实现了金鲳鱼的高附加值利用。此外，本发明方法原料成本低，生产工艺简单。