本发明属于鱼类分子遗传学DNA标记技术领域，具体涉及云斑尖塘鳢微卫星位点的快速高效筛选及应用。本发明包括：大质量DNA酶切，连接；低循环次数的Pre-PCR；利用生物素标记的探针与链霉素磁珠构建微卫星片段的富集文库；筛选阳性克隆，并通过二次筛选进一步提高微卫星位点的检出效率；使用得到的微卫星引物进行群体遗传分析。本发明改进了现有的磁珠富集法，高效快速地筛选微卫星位点；减少测序成本；同时克服采用同位素进行二次筛选在安全上的不足。所获得的微卫星标记为云斑尖塘鳢的种质资源保护、种质改良及遗传选育等方面提供科学依据和检测手段。