本发明公开了一种马蹄蕨多糖中果糖和D‑无水葡萄糖的含量测定，包括以下步骤：首先制备马蹄蕨多糖；其次，进行样品溶液的制备：取马蹄蕨多糖，置容量瓶中，加入水，于水浴中加热，取出，超声提取，放冷，流动相定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得样品溶液；最后进行样品测定，色谱条件：采用ZORBAX NH2色谱柱，柱温为40℃，流动相：乙腈－水(72：28)，流速为0.8mL/min，进样量为10μL；蒸发光散射检测器的检测条件：漂移管温度为50℃，载气流速为2.0L/min，增益为1；本发明中的检测方法既能对马蹄蕨多糖中各单糖进行分离，又可对其中某些已知单糖成分进行定量分析，且方法简单，灵敏度、稳定性和准确度较高。