本发明涉及一种左亚叶酸中有关物质的检测方法，属于化学药物检测方法技术领域。本发明提供的检测方法包括采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；所述流动相A采用包含四丁基氢氧化铵的磷酸氢二钠缓冲液；所述流动相B采用甲醇；溶解样品的溶剂采用包含流动相A、流动相B和二甲亚砜的混合溶剂。本发明检测出的杂质多，且都能有效分离，能快速、有效、准确监控左亚叶酸中的有关物质。本发明专属性高，灵敏度高，回收率高，通过采用外标法和自身对照法结合的方式对杂质进行定量检测，能够增加本发明有关物质检测的准确性。