本发明公开了一种同时测定脱氢苯基阿夕斯丁类似物及其多种异构体含量的高效液相色谱分析法，所述的脱氢苯基阿夕斯丁类似物为(3Z, 6Z)‑3‑((E)‑3‑(5‑叔丁基)‑1H‑咪唑基‑4‑基)亚甲基)‑6‑((E)‑3‑(3‑氟苯基)‑2‑丙烯亚基)哌嗪‑2, 5‑二酮，具体的检测方法为采用色谱柱五氟苯基化学键合硅胶柱(250×4.6mm，4μm)，以水‑甲醇为流动相，等度洗脱，柱温为50℃，流速为1.0ml/min，检测波长为375nm。该方法可快速准确的检测出所述的脱氢苯基阿夕斯丁类似物及其多种异构体含量，操作简单，重现性好，灵敏度高，为脱氢苯基阿夕斯丁类似物的原料药及制剂开发提供了质量保证。