本发明涉及天然药物化学技术领域，具体公开了一种具有抗肿瘤作用的中药组合物及制备方法和应用。所述的中药组合物由包含如下重量份的中药制成：人参1～5份；黄芪1～5份；铁皮石斛1～3份；蒲公英1～3份。该组合物优选地制备方法包含如下步骤：(1)将人参、黄芪、铁皮石斛以及蒲公英混合后，加乙醇水溶液进行提取，浓缩提取液得醇提取物；(2)将醇提取物加水混悬，用乙酸乙酯萃取1～3次，浓缩乙酸乙酯萃取部位，得乙酸乙酯萃取物；(3)将步骤(2)所述的乙酸乙酯萃取物经ODS柱层析富集有效成分后即得所述的具有抗肿瘤作用的中药组合物。所述的中药组合物所述是通过调节肠道菌群来增强免疫力，从而预防肿瘤的发生；实验证明经本发明所述方法制备得到的中药组合物具有增强免疫和抗肿瘤作用；因此，采用本发明所的中药组合物可以用于制备调节肠道菌群以及具有增强免疫和/或抗肿瘤作用的药物或保健品。