本发明公开了一种生物法制备脱水穿心莲内酯的方法，包括如下步骤：步骤S1，菌种培养；步骤S2，微生物转化；步骤S3，转化产物提取；步骤S4，高速逆流纯化；其中，步骤S1中的发酵培养基中添加有有效浓度的离子液体。本发明提供的制备方法可以以常见易培养的短刺小克银汉霉为转化菌株，在发酵培养基中添加特定结构的功能离子液体，将穿心莲内酯转化为脱水穿心莲内酯；同时，若在发酵培养基中添加有效浓度的缬氨酸，可以提高该转化反应的选择性。