本发明属于质粒载体构建领域，提供一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。该穿梭质粒载体是由嗜水气单胞菌质粒pBK760与载体pMD20连接构建而成。本发明提供的穿梭质粒载体可在大肠杆菌和嗜水气单胞菌中复制。嗜水气单胞菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该穿梭质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建，便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。