本发明提供一种利用无致病性的根癌土壤杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。本发明从土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的根癌土壤杆菌S2‑323，利用菌株S2‑323合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒，并在肥料、饲料、富硒功能食品加工、保健品及医药产品中应用。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒用于富硒肥料、富硒饲料，施肥或饲喂后，作物、瓜果、蔬菜、肉蛋奶富硒效果显著。