本发明属于医药技术领域，涉及一种抗生素类药物化合物杂质的精制方法，具体涉及美洛西林钠杂质C、D和F的分离制备方法，本发明公开的美洛西林钠杂质C、D和F的制备分离方法，包括以下步骤：以美洛西林钠为原料，高温处理制得美洛西林钠杂质C、D和F，经分离纯化分别获得美洛西林钠杂质C、D和F。该技术方案可同步制得三种美洛西林钠的杂质化合物分子，极大地提高产物的合成效率。本发明的技术方案通过半制备型液相色谱系统，三种杂质的分离度好，获得产品纯度高，分离时间短。