本发明提供一种同时检测结核分枝杆菌利福平与异烟肼耐药基因点突变的方法及其试剂，所述方法基于ARMS荧光定量PCR方法，在相同的反应体系中，分别使用针对所述耐药基因突变位点的突变型模板的ARMS引物和针对野生型模板的ARMS引物及它们共用的上游或下游引物，用突变型反应管与野生型反应管共两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过各个点突变在两个反应管中的荧光PCR的Ct值和ΔCt值的大小判定样本的基因型。本发明的方法操作简便，可在短时间内通过多重检测，检出结核一线药物的主要耐药位点。