本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种再利用培养基及其制备方法和应用，所述再利用培养基包括如下重量百分比的原料：废弃蛹虫草培养基5.0%‑10.0%、1/2MS培养基0.8%‑1.0%、白砂糖1.0%‑1.5%、琼脂1.0%‑1.5%、水余量。本发明的再利用培养基环保，原料易得，天然成分高，成本低。本发明的再利用培养基的应用可以满足石斛原球茎培养基直接生长成种植苗，减少一次转接，缩短生长周期。