本发明属于蚕丝蛋白纳米纤维的制备技术领域，涉及一种pH敏感型蚕丝蛋白纳米纤维及其分散液、制备方法和应用。本发明的制备方法，包括：向酸性溶液中加入蚕丝，得到混合液；将所述混合液进行恒温加热，搅拌，得到固体悬浮液；分离所述固体悬浮液中的水不溶物，将所述水不溶物洗涤至中性，得到pH敏感型蚕丝蛋白纳米纤维。该蚕丝蛋白纳米纤维是不溶于水的结晶结构，不会发生构象转变，不会发生凝胶化，可以稳定分散于水溶液，具有良好的pH响应性和生物相容性。本发明采用的制备方法工艺简单，无毒无害，提高了蚕丝蛋白纳米纤维的得率，为实现蚕丝蛋白基生物质资源的高效利用提供了新思路和新方法。