本发明涉及一种利用荧光PCR技术定量检测Epstein‑Barr病毒(EBV)核酸的试剂盒。它采用一对引物扩增EBV特异性核酸序列，并通过荧光探针定量检测EBV DNA；同时用人内源性基因特异性引物和荧光探针检测内参照DNA。本发明通过单管双波长荧光PCR技术同时检测EBV和内参照核酸的存在，能定量检测全血、血浆、鼻咽分泌物样品中EBV DNA，通过内参照核酸的检测结果判断样品是否存在PCR抑制剂或检测误操作引起的模板丢失。试剂盒操作简便快速、定量结果灵敏准确，可广泛应用于临床EBV病毒感染的定量检测。