本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失疫苗株及其构建方法和应用，属于医药技术领域。本发明所述的猪伪狂犬病病毒gE/gI双基因缺失株疫苗株是在猪伪狂犬病病毒BJ株的基础上，通过敲除gE和gI双基因构建得到的；其中，所述的猪伪狂犬病病毒BJ株，命名为BJ，该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.15911。实验证明，使用本发明制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗免疫初产健康猪用于预防猪伪狂犬病，具有安全、产生抗体快、免疫期持久等优点。并且能够与相应的DIVA(能区分感染与免疫动物)战略相匹配，在猪伪狂犬病防治领域将具有广泛的应用前景。