本发明提供了一种兔圆小囊抗菌肽的制备方法，属于生物医药技术领域。所述制备方法将兔圆小囊匀浆，将所得兔圆小囊匀浆液与乙酸溶液混合，2～5℃下浸提12～14h，得到浸提液；将浸提液反复冻融4～6次，得到冻融液；将冻融液依次进行多层过滤、微滤和超滤，得到超滤液；调节超滤液的pH值为6.5～7.2，即得兔圆小囊抗菌肽。本发明所述制备方法所得兔圆小囊抗菌肽中多肽含量达到1.0mg/ml以上刺激指数均在1.10以上，即所述抗菌肽的纯度较高，从微滤到成品所需提取时间大大减少，仅需3～4h。本发明所述制备方法能够简化操作、降低对操作人员专业化程度的要求，可降低成本，有利于兔圆小囊抗菌肽的大规模工业化生产。