本申请涉及一种同时检测23种脂肪酸的试剂盒及其检测方法。其中所述的23种脂肪酸分别为：C14 : 0、C14 : 1、C16 : 0、C16 : 1、C18 : 0、C18 : 1、C18 : 2、C18 : 3‑α、C20 : 0、C20 : 1、C20 : 2、C20 : 3、C20 : 4、C20 : 5、C22 : 0、C22 : 1、C22 : 2、C22 : 3、C22 : 4、C22 : 5、C22 : 6、C24 : 0、C24 : 1；该方法采用高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述23种脂肪酸，先利用高效液相色谱将23种脂肪酸分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述23种脂肪酸的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，3min可完成23种脂肪酸的分离和检测，精密度和准确度基本满足要求。