本发明提供了一种油佐剂疫苗的精确定性定量检测方法，包括以下步骤：将油佐剂疫苗破乳，将破乳后的抗原样品进行定量分析，同时采用凝胶电泳的手段进行纯化，然后将纯化后的抗原样品进行定性检测；所述破乳方法为：将油佐剂疫苗与破乳剂混合，分层后得水相抗原样品；所述破乳剂包括有机溶剂与酸的混合物，所述有机溶剂选自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一种，所述酸选自盐酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一种。本发明提供的破乳方法破乳能力更强，能保证抗原主要分布于水相中，且水相与油相能完全分离，能真实反应出疫苗内有效抗原的含量及质量；通过将破乳后的抗原采用电泳进行分离纯化，提高了抗原的纯度。