本发明属于生物技术领域，涉及一种循环microRNAs检测试剂盒和特异性检测循环microRNAs的方法及应用。该试剂盒包括：具有粘性末端的发卡结构DNA，其一部分与目标microRNA的至少一部分互补配对；双链特异性核酸酶及反应缓冲液；环状DNA探针，其一部分与发卡结构DNA的一部分互补配对；任选的以下组份之一：SYBR Gold荧光核酸染料；DNA聚合酶；DNA聚合酶反应缓冲液；4×dNTPs。本发明采用双链特异性核酸酶介导的靶标循环反应和滚环扩增反应对循环miRNAs进行特异性检测，既可以降低检测背景又可以起到双向信号放大的作用，具有操作简单、检测快速，灵敏度高、特异性好和成本低等特点。