本发明公开了一种南极磷虾中虾青素双酯参考物质的制备方法。将冰冻南极磷虾冻干、研磨，获得含有天然虾青素的南极磷虾粉原料，利用冷丙酮提取，减压浓缩后通过溶剂分级去除水溶性脂质，采用硅胶柱层析进行分离纯化收集，经浓缩、冻干后，可以得到虾青素双酯。本发明的有益效果是能作为参考物质用于海洋资源中活性物质的检测，为在保健食品、医药和饲料等领域的应用提供技术支持与物质保证。