本发明为高效分离纯化纽莫康定(Pnemocandin)的方法，解决已有分离纯化纽莫康定的方法回收率较低，难以回收利用洗脱溶剂，不能同时分离多种近似杂质, 分离过程中产品的稳定性差的问题。其步骤为将经大孔吸附树脂洗脱分离得到包含纽莫康定A0、B0和C0三种组分的粗品用乙醇溶解，硅胶作为填料进行柱层析分离，洗脱剂选用低沸点中等极性溶剂、高沸点醇和水组成的三元溶剂体系，洗脱液经浓缩、重结晶而得到高纯度纽莫康定B0。由本发明方法制备的纽莫康定B0纯度极高、更高效地一步分离A0、B0和C0组分，方法操作简单、洗脱剂易回收，利于工业化应用。