本发明公开了一种DNA的测序方法及一种二代测序文库。本发明的测序方法经过待测DNA片段和随机引物Read2‑NB混合进行延伸反应，将所得延伸产物的3’端与双链接头Read1‑Adapter中含测序平台特异序列的b链连接，取特定引物T1和T2扩增连接产物，从而完成二代测序文库的构建，随后进行测序。本发明可以对双链DNA和/或单链DNA进行文库构建和测序，所需起始DNA量降低，针对模板DNA有限的样品的适用型强，并且从测序结果可直接区分出目标单链DNA原始模板序列。