本发明涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建。该病毒株是以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学手段，缺失伪狂犬病病毒的gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的5基因缺失病毒株(rPRV/gE‑/gI‑/US9‑/△UL49.5/TK‑/GFP+/RFP+)。本发明建立了一套伪狂犬活病毒载体系统；双荧光蛋白标记便于今后基因工程操作的筛选和鉴定；可同时插入多种外源基因，较一般活载体系统更加高效。该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。