本发明提供一种测定透明质酸含量的方法，其包括：利用透明质酸酶对包含透明质酸和柠檬酸的待测样品进行酶解；使用用于分析有机酸的离子交换柱，利用不含盐的流动相，检测由透明质酸酶酶解后的透明质酸；以及基于检测结果计算透明质酸的含量，其中，高效液相色谱中使用的柱温为60℃～95℃。本发明的方法特别适合于检测含有柠檬酸的物质中的透明质酸的含量。