本发明提供了一种超高效合相色谱‑质谱联用定量检测生物样本中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的方法。本发明将待测生物样品进行前处理后，对待测液进行超高效合相色谱‑质谱联用检测，再根据检测谱图中左旋兰索拉唑/右旋兰索拉唑和内标物的峰面积以及标准曲线，通过内标法计算得到待测生物样本中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的浓度。本发明首次将超高效合相色谱(UPCC)与三重四级杆质谱(MS/MS)联用用于生物样本中手性药物的定量检测，本发明提供的方法灵敏度高，可满足具有样本量少、含量低以及基质复杂特点的生物样本中手性药物的分离，且检测时间短、成本低。