本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种抗手足口病药物活性检测方法及其试剂盒。该检测方法包括：将编码Gln‑Gly的核苷酸序列插入荧光素酶质粒，经体外非细胞转录翻译获得含Gln‑Gly的重组荧光素酶；体外重组表达手足口病毒蛋白酶，手足口病毒蛋白酶为2A或3C蛋白酶；手足口病毒蛋白酶与含Gln‑Gly的重组荧光素酶、受试物发生酶促反应，检测荧光素的生物发光强度，获得受试物的抗手足口病药物活性。本发明检测方法具有简单、微量、快速的优点，药物筛选工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于抗手足口病药物的筛选与开发；本法基于萤光素酶的生物发光检测方法，灵敏度高，干扰因素少，受试品兼容性强。