本发明涉及生物医药技术领域，提供了一种抗登革病毒DE3的纳米抗体、制备方法及应用，该抗登革病毒DE3的纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，编码该纳米抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过亲和力分析本发明的纳米抗体具有良好的亲和力，通过体外病毒中和试验，本发明的纳米抗体具有登革4型病毒特异中和活性，并且病毒的中和活性具有浓度依赖关系，说明本发明的纳米抗体具有潜在的的抗登革病毒的作用，对登革热流行或爆发具有优良的预防或治疗作用，具备广阔的临床应用前景。