本发明涉及生物医药技术领域，特别公开了一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用。本发明中利用硫酸铵盐析、柱层析等技术对枯草芽孢杆菌发酵液中的蛋白酶进行分离；蛋白质电泳显示分离的蛋白质是一组分子量低于20 kDa的组分；纤维蛋白平板法及体内外活性实验证明该低分子量纤溶酶可直接降解纤维蛋白，产生溶栓活性。加入胰蛋白酶不影响其活性；利用肽指纹图谱法与蛋白质N‑末端分析技术对该低分子量组分进行鉴定，表明其为一组具有序列表SEQ ID NO：1‑5所示的氨基酸序列组成的多肽。本发明提供的具有溶栓活性纤溶酶分子量小、活性强、不被胰蛋白酶降解，其在保健食品、溶栓药物开发等领域具有广阔开发前景。