本发明公开了一种茶花粉分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)取茶花粉，脱脂处理；(2)取步骤(1)脱脂茶花粉，破壁处理得到花粉溶液；(3)向步骤(2)得到的花粉溶液中，加入去离子水调整固液比为1 : 20‑80，调节pH至7.5‑12，恒温搅拌，离心取上清液；(4)调节步骤(3)收集的上清液pH至3.0‑5.0，离心分离出蛋白，洗涤后将蛋白液pH调至7.0，冷冻干燥得茶花粉蛋白。本发明制备方法采用多种破壁工艺，提高了蛋白质的得率，其中通过考查和比较蛋白质得率和蛋白质水解度，酶解‑超声复合破壁工艺效果最好；本发明制备所得茶花粉蛋白经过模拟胃肠道消化后所获得的水解物具有抗疲劳抗氧化的活性。