本发明公开了一种固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法。所述固定化头孢菌素C酰化酶包括ES‑1树脂和固定于ES‑1树脂上的头孢菌素C酰化酶。所述制备方法包括下述步骤：将ES‑1树脂和头孢菌素C酰化酶溶于0.5‑1.0mol/L，pH 7.0‑10.5的磷酸盐缓冲液中，15‑35℃固定化8‑20h。本发明提供了一种与现有技术相比固定化时间短、酶活回收率高的固定化头孢菌素C酰化酶的方法，解决了现有技术高生产成本的问题，更适用于工业生产。