本发明提供了一种用HPLC分离测定依帕列净原料药有关物质的方法，包括如下步骤：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～40℃，采用紫外检测器对依帕列净原料药的有关物质进行检测，所述紫外检测器的检测波长为205～230nm。本发明所述的用HPLC分离测定依帕列净原料药有关物质的方法，通过综合考虑分析柱、流动相、梯度洗脱程序以及流速、柱温对分离检测的综合影响，从而有效的控制原料药的质量，并且该检测方法灵敏度高、专属性强、精密度高、准确性强、快速简便、操作方便，适用于分离测定依帕列净原料药的有关物质。