本发明涉及线粒体DNA分子检测领域，特别涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内。本发明巧妙地将长程PCR的两条引物均设计在人类线粒体DNA的重链复制原点邻近区域，避免了因为引物落入删除区域而导致漏检的问题；本发明的扩增区域长达16397bp，几乎扩增整个环形线粒体DNA，可覆盖环形线粒体DNA上几乎所有可能的删除类型，形成了一种检测范围广、灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法。