本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪组织冻存液、冻存方法及其应用，所述冻存液包括DMEM培养基、蔗糖、丙二醇、脯氨酸、四氢甲基嘧啶、超氧化歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、生育酚。本发明制备的冻存液中没有添加血清，避免了病原微生物的污染和排异反应的发生，且没有添加具有强烈毒性的DMSO，避免了培养出具有毒性的脂肪组织。本发明对脂肪组织的冻存效果好，脂肪组织细胞活性高，细胞凋亡率低，且制备方法简单易操作，可为该领域的研究和发展提供新的思路。