本发明提供了一种血清尿素测定试剂及其应用，所述试剂包括试剂R1和试剂R2；其中，所述试剂R1的原料包括Capso、NADH和EDTA.Na2，所述试剂R2的原料包括HEPES、ɑ‑酮戊二酸、尿素酶、谷氨酸脱氢酶、EDTA.Na2、还原剂和BSA；本发明通过优化试剂配方，调节缓冲液pH，提供了有效的缓冲能力，改善NADH的稳定性，减少了工具酶的氧化，各组分协同增效，解决了空白吸光度变化率稳定性欠佳的问题，提供了医院临床检测结果的可靠性，具备广阔的前景和巨大的市场价值。