本发明涉及一种空白生物样品的制备方法，具体地，本发明的工艺包含：(1)用酸性/碱性条件，使与蛋白质结合的维生素发生分离，使其释放出内源性的维生素；(2)用吸附材料将解离出的维生素吸附；(3)通过高速离心，将吸附材料与生物样品分离，得到不含有维生素的空白生物样品。本发明的制备工艺，能够有效地去除生物样品中内源性的维生素类化合物，且可以最大程度保留生物样品的特性，可以为临床定量检测维生素类化合物提供与待测生物样品类似的基质环境。