本发明公开了一种分离卡非佐米和其异构体的高效液相色谱方法，色谱参数如下：色谱柱：Agilent ZORBAX Extend‑C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相：体积比为75 : 20 : 5的水‑乙腈‑四氢呋喃溶液，其中含有20mM(2S, 4S)‑1‑Boc‑4‑氨基吡咯烷‑2‑甲酸甲酯；流动相B相：乙腈；梯度洗脱程序：0～8min，0％B；8～35min，0％～100％B；35～40min，100％～0％B；流速：1.0mL/min；柱温：35℃。本发明通过添加手性试剂(2S, 4S)‑1‑Boc‑4‑氨基吡咯烷‑2‑甲酸甲酯使用常规的C18色谱柱即可有效分离卡非佐米、对映异构体、非对映异构体Ⅰ和非对映异构体Ⅱ，分离效果优异，分离检测成本低廉。